细工生物就器官培养的要求及特点就要点与关注重点-临床应用无障碍为目的
1：离体后首代培养基重点开发、可行性、稳定性、重复性高。细胞活性高（建系标准为目的，国产培养基备份替代体系）应用无BUG为最终目的。
2：在体外条件下,由于缺乏血液循环系统,器官培养物的养分及氧气的供应主要靠自然渗透
。要点是成球后，增值速度，细胞团质量。我们解决该问题优势是易成团成片类细胞系技术储备充足，不管那个厂家,通用，在后期增殖可行性明显，北京用户有富裕样本的，我们可做预实验比较。外地用户在讨论。外地能协作的实验室，建议细胞系方面先合作半年后可委托。
可讨论内容，给出详细资料，问题描述，目的需求，厂家不公开的不好判断，只能通过技术储备过的资料判断（生长特性要描述清楚），较被动。
1：器官培养的取材
2：培养基
3：培养环境中的气体
4：培养器官的支持物
以下参考，可讨论【注意事项】
器官培养的方法及应用
国内技术储备，可行性更高。
固体培养基器官培养法
小鼠肠上皮类器官的培养
液体培养基器官培养法
毛囊的器官培养
肝芽类器官培养
动态器官培养法
全胚胎培养
大鼠组织工程肝脏的灌注培养
;组织工程肝脏内部肝细胞
体内器官培养法
人源肿瘤异种移植模型
三维细胞培养技术
肿瘤细胞球培养
基于生物材料/多孔支架培养
基于胶原凝胶体系培养胚胎干细胞
大鼠鼠尾胶原溶液制备方法步骤
尾腱的结缔组织层
基于胶原-matrigel 基质胶体系培养乳腺上皮细胞
邮件联系-内容较多，了解需求后，在沟通会精准些。
超量培养后，细胞膜纯化（蛋白纯化）高手请留步，应用国产产设备与技术老师更欢迎联系（相关可中试纯化对接项目，技术优势请介绍）。讨论相关重点。
配合免疫细胞压力测试-类器官
转染前悬浮驯化贴壁-转染
机器人需悬浮生长驯化贴壁生长等
20230316 可通过促贴壁试剂驯化，把悬浮细胞特性细胞，驯化成贴壁生长，配合相关设备完成细胞拉伸工作，转染，共聚焦等需求实验，进行测设。
其他需求可讨论，去掉该试剂，细胞恢复原特性。
20230318 三维立体后营养传输障碍是我司重点攻关目标，配合压力、机械力、化学组分（营养渗透）以化学试剂部分为主，对细胞系问题常年统计，各类培养中难点特点了解还算深入，以保种建系为自律标准，各类难养可参考我们其他相关介绍。并结合培养基开发，推荐方案考虑方案完备性，可行性较高，都建议在细胞系前期验证后，在应用目的细胞，优点是，细胞系验证通过，培养体系固定，只考虑其他POTOCOL比较可行稳妥。参考建议对照GIBCO，LONZA是我们常年统计后推荐比较厂家。特殊难养细节部分都可讨论。我司在离体步骤，首代培养基推荐，及后期增值，做较详细内容统计。
目前也考虑代理细胞压力，拉力相关设备厂家产品，拿到更多相关培养中问题，发挥我司细胞培养方面的优势。
我司类细胞培养主要思路，单克隆后，增殖相关提速训化培养（保种体系优势明显），超量2D培养后，在做成球相关，优势是细胞质量统一，后期维持培养球质量高，如能解决传输障碍配合，极限球后增殖应该有明显优势。
相关关键词：钙，细胞膜提取及营养递送，原代稳转珠建系（转染试剂部分统计，难转细胞统计），超量培养相关，含血清方案为主，细胞工厂2D为主。超量细胞2D规模转染，蛋白纯化技术储备。
重点地区我们配合实验室完成：武汉，武大为主，杭州，西北工业大学，北京。
230831：关键词里都是我司统计并开发相关产品，从POTOCOL可行并优化中，每个细节所用方法试剂都可深入讨论，离体处理设备试剂自动化容错率更高并可行一直是我们研发重点（国外顶级品牌效果也不是很理想，国内公司较保守，真正可行方案应该还不是很成熟，首代消化优化（涉及传代，有慢病毒腺病毒辅助建系需求的，高滴度蛋白生产我们有很好的方案。疫苗相关应用很成熟了，可参考增强贴壁试剂内容），维持培养基开发（种子库用基础培养基DMEM，1640长效谷氨酰胺，无血清培养建系都可讨论，细工优势细胞系中难养类细胞统计较多，结合后应该有比较稳妥方案推荐，因用量较大，成本控制，自产国产备份厂家，应用理由来自难养细胞自产试剂，gibco,lonza相同培养基交换互养能顺利对接，按理细胞HUVEC，NK92,肝类，乳腺类等。欢迎详细讨论沟通。不建议自闭式研发。国外厂家啦的我们很远了。可行型很重要，别像PDX那样的结果，当年很多实验室做PDX时，就建议用户PDX与培养一起做，就算PDX不成功，细胞培养好了，后面也会用到。关于冻存，我们一直在做DMSO方案优化，建议也用这个方法冻存细胞。那种无DMSO冻存液如果复苏不顺利，不太好分析原因（老师多份备份方法，并几十年的成熟应用，即便出现问题，也好分析，技术储备充足，冻存部分来自免疫细胞统计。
20230905 建系保种推荐，PDX最后没有到临床，很多技术经验很珍贵，只是在类器官应用上多加些实验，把方案可行性多加些应用。目前建系技术上，理论上，配套试剂方法可行性很高。细节可讨论。细工所生产开发培养基等试剂，全部按建系水准开发，性价比高，可行性高，技术储备足，解决问题思路广，尽量做到总有第二备份方案。细节要详细沟通。可行性建议GIBCO，LONZA能更好重复，容易重复。学习中进步。
20230906: 类细胞长期培养还推荐，无血清建系，含血清建系。北京用户可参与讨论的课题组，相关研究细胞，力学、压力、磁力细胞相关课题组，可在细胞培养方面互通有无。
20230912:细工经统计与自身对细胞系技术储备结合，明确我司类细胞（类器官）先建系，明确细胞身份后，建系后再成球或其他相关实验，对药物评价方面研究也可先二维常规培养验证预期（优势各实验室都很熟悉，相对容易很多）有明显预期结果后，在做成球方面深入研究。肿瘤与正常细胞可同时进行。
就上述方向细工优势：建系用慢病毒腺病毒相关蛋白高产几年来是我们重点开发的方向，企业工业用户相关应用也很满意。
相关可讨论：种子来源（评价及推荐，各厂家优略参考意见），试剂保种体系国产备份，技术细节统计及储备。耗材推荐参考。细节处反复强调，最终目的是建系成功。可重复性高。
离体后处理问题讨论（各组织来源不同，我们结合难养系常见问题参考补充）。
培养体系优化，建系需大量试剂，对成本要求高，协和细胞库培养经验与可行性我们认可并学习。经难养系多厂家反复互换培养，得出参考意见是，用更高体系完全兼容普通培养体系（一定要大厂家，成分可查，厂家研发提供较详细资料，我司总结的正常肝细胞系非常有参考案例（thle-3对ATCC官网公开部分常年统计，对现状类器官培养基我司片面意见是，成分太多了，简单阐述是，原代，腺，神经类各种营养因子都有，培养后目的细胞不明确，肿瘤，正常，巨噬等，后面用途可能会更模糊（个人意见，说的不对处，老师谅解并提携指正）
干细胞球消化对不加载体类细胞直接成球很有参考意义，干细胞相关研究国内有很多大牛实验室一直在做。经验很丰富。
微载体方法建议用下我们促贴壁试剂比较，球传球，优势明显。

关于直接成球方法，我司正准备上胚胎培养基试试，球增殖较难，居于文献面太窄了，有上相关实验后的细节问题都可讨论。胚胎培养大牛实验室要路过，给发个联系方式，后面有问题需咨询。
合作实验室已经应用好几年了，这两年类器官公司相关出来很多，有点懵，静下心来，明确我司方向，建系后成球相关为主。长久方向。欢迎技术参与留言。
20231006: 国内珍贵细胞系救助，单克隆后保种，从耗材，试剂，手法等内容详细讨论保种要点。
国内自建系优化保种：近年有些实验室有自己建系，了解大概情况是建系后传代天数较长，提高生长速度也是很关键指标（来自常用系常规特点，一般好养的系长满传代也就一两天，难养的三四天就算很长了） 如果没有达到这个指标，国内建系很难保证后续相关实验，优化试剂，耗材，手法，例如冻存建议还是用传统DMSO方案比较稳妥（ 该方案相关问题都有很长时间的技术储备与解决问题经验,案例细胞复苏率很高，接近100%，PBMC,优化细节可讨论）较新的无血清冻存液应用，暂时统计数据也只是无血清培养体系还比较适合，更多相关统计都可讨论问题细节。干细胞相关数据还很少，上述只做细胞系类参考。细胞系类问题经验统计来自国内正规库学习与平时销售问题总结统计（保种体系观点是细胞系可长期使用，需该观点可长期就前言问题讨论保种优化）
20231008：建系技术内容讨论： 建议技术部分全部共共享，难点问题涉及上下操作与解决思路非常关键，就难养难建系肝，乳腺我司目前解决思路可深入讨论，建系用高低渡病毒我们提供上游全面技术资料，可委托生产或合作生产，建议有GMP生产资质的合作，产品较稳定，我们可提供大面积用户测试评价。目前了解到的情况还无相关高低渡厂家（国内国外） 只为建系目的，其他应用可在讨论。
20231012:细工建系培养目的只是类器官辅助实验目的，国内建系技术学习与补充，一直在做细胞系培养中问题统计，有些基础方面技术储备。
20231111：类细胞建系，成干培养细节可讨论，结合我司胰酶或无酶消化。
另：结合成干培养减二氧化碳（路过实验室要有该培养条件可发我司邮件，后面相关问题开始统计与学习）
结合难养类免疫悬浮处理手法，关键点慢生长、柔和处理、利用上清、比较适合无问题解决思路，无文献支持。可参考。也适合普通细胞系成瘤差问题尝试及备份方法之一，上述推荐理由是成干后控制或减轻分化为主，上述只是类细胞培养方法补充及备份方案，可行性可讨论。
20231118：类细胞离体后培养慢操作可行性统计，经历多年难养类细胞统计总结，有几点与原代初代特性类似，前体进口试剂耗材种子库级别，
生长天数4-7天
对胰酶敏感，操作步骤轻柔，成团厉害影响前期增殖，可先参考我们优化胰酶方法原理，在试应用前期解决增殖，细胞培养量满足后，在成球成团。
传代后拿出观察频率较多温度变化，锚着力的影响
瓶子更优
上清利用
维持培养天数更长
常规流式损伤如何避免，气相流式，国内重点室应该都有相关设备了。
建系需更优状态
国内水平现有条件培养体系开发，因子，完全培养基，可行性开发等
提纯后先单类培养，在混合培养，芯片方法中悬浮，贴壁反向驯化。
上述也是我们解决难养类常用统计问题描述及解决思路，深入讨论可邮件联系
20231122
低成本需求培养体系问题解决讨论参考
如果预算少，我们可讨论普通试剂耗材可行性，国产试剂耗材国内2020年普及很多，我们本身就是细胞问题统计类公司，目前已有些相关解决案例，加十年进口试剂耗材统计经验及难养细胞统计储备资料结合，应该能有些突破性进展。问题描述要详细，目的需求说清楚。
理由参考，1：培养前辈书籍重温、2：国内相关试剂耗材生产及应用相关统计及解决方法和思路（相关耗材，试剂生产商有如有培养方面研发，售后问题，或者长期验证等实验，都可讨论关键相关参数）。
20231126
无血清方案难度相对大很多，成本费用太高，经历过相关细胞系统计建议参考，我们统计无血清细胞系也只有人正常前列腺上皮细胞RWPE-1这一只无血清培养优于含血清方案，国内这类只接触过国内正规库做了统计（公司较小业务面还比较窄，老师参考），为保证实验成功率更高，细工建议先含血清方案离体后保证成功率（国内这类培养基研发机构，要觉得可行，相关培养基我们有更多研发思路可讨论），成功后在上无血清，充足细胞量可给实验带来更多充足储备。若考虑含血清方案，我们促贴壁试剂替代Matrigel可行性很高，也有五年以上相关细胞应用。把握比较大。试用免费（需告知实验细节以便问题统计，便于产品升级用）
国外大公司纯无血清替代也就一两家头部企业很成熟，该类判断理由是无血清293做了数据统计，无需补料（也说明技术成熟），最近该公司收购相关因子规模生产企业，也说明在大量培养上做后面市场规划（参考），各类相关问题欢迎来信讨论。明年我们减血清培养基下线，结合国内国产试剂耗材普及率逐步扩大，我们也做了一年多相关统计储备（这是我们优势），遇到相关问题都可讨论（黑点观点可参考广谱杀菌介绍，只要培养基澄清，我们都可讨论解决办法可试行补救，不建议放弃实验）您要不放弃，细工永远在。我们后面准备统计巨噬M2继续培养可讨论，继续培养理由，老师有机会接触到协和细胞库老师，可咨询他们分化后维持培养结果。很值得参考。关于杯状细胞等，后面有验证在公布结果。说的不对处，老师请指正。
人正常前列腺上皮细胞RWPE-1
无血清案例细胞介绍
这株细胞的基本培养基作为Invitrogen (GIBCO)提供的kit的部分:角化细胞无血清培养基K-SFM，kit目录号17005-042。随kit提供这株细胞生长所需的两种添加剂（牛垂体提取物BPE及人重组表皮生长因子EGF)。配制完全生长培养基，需添加以下成分:0.05 mg/ml BPE一随K-SFM提供5 ng/ml EGF -随K-SFM提供。注意:不要过滤完全培养基。
特征特性
20231202
黑点、生长慢，类器官痛点-（黑点结合我们广谱杀菌比较完整解决）
生长慢，细工统计后，给出方案是进口瓶培养（康宁，nunc,德国产细工全部现货） ，种子库级别试剂（三千以上胎牛，我司验证五年以上南美）我司培养基或者是GIBCO培养基，放足培养基（多些也没关系）几天不动，看下恢复情况，结合我司胰酶（无损消化）传几代应该能找回较好状态，该方法也适合细胞养几代后就爬爬这种情况（上述方法也适合细胞养传代后细胞就爬爬这种情况，该因素原因很多，具体情况集体分析）该方法也建议原代首代培养（类器官）就是普通培养基加胎牛（因子贵，lag phase长、无血清不稳点）全部能替代，细胞够多或稳定后在上无血清可做参考。类器官配套耗材U型低（不加辅助条件成球）及磁珠配套磁力成球可来信告知索取资料及技术讨论。邮件联系
类器官痛点
复苏还可以，传几代传到三代就完蛋，越长越少-细工复苏有很好的优化方案，后面有冻存挑剔的细胞可讨论。
状态差，每天换新，因子消耗大成本高，不见起色，可气的是养养还失踪了，-上述可行性高，且稳定，常规培养手法也熟悉。
开始还比较满意，传代也不错，传几代后，集体自杀了。--稳定的可靠的把把成很重要。
类器官成球后维持培养，细胞也会出现黑点情况，这步结合看待细胞系黑点也有参考作用，关键词：吹打，培养体系种子库级别，冻存复苏等结合看全部，是我司解决细胞系黑点，生长慢做些技术储备，顺便也给类器官做些参考。试剂耗材细胞都到种子库级别，建议养下去，给难题问题做做些技术储备。培养中问题细节可详细沟通。
我司试剂耗材，成本原料，自律高，成本高，为维持保种，种子库体系稳妥可行，只能全部涨价30%，对接类器官痛点难点也有很充足技术储备（离体处理，消化，培养，维持，冻存复苏等），统计有十几年各种难养类细胞系，减少成本几乎为零，我们买的不是产品，责任更大些。解决问题可行性才是硬道理。
20231206:痛点应用拓展，种子库，转染后细胞状态差恢复，耐药株复苏回复，原代应用，成干应用，例如骨研究需长久培养，成瘤不理想株备份方案，细胞需长期培养，慢操作、缺氧培养、减慢分化或避免分化，分化后长期培养探索.
长期统计小心德，难养株与原代传代时间大部分相同，细胞系黑点与类器官长期培养黑点，都有类似特点，所以有了上述问题解决思路与配套解决思路参考，应用解决了几个案例非常理想。

20231217  年底总结：从痛点看，无血清方案难度甚大，结合国内生产研发行特点，细工推荐含血清方案（已有肝，胰岛胰腺类，肠类）五年左右合作实验室经验，先2D,在成球。已有磁珠辅助磁力架成球，可行性高，东南大学相关芯片研究，及目的清晰明确（用户参考） 原理目的用途都很明确，明年细工在DMSO传统冻存复苏重点解决原代复苏活率，目前原代PBMC已经能到很高活率，还会优化下去，相关培养统计重点，细胞膜提取，巨噬培养分化控制，有兴趣老师可邮件联系。

20231221：类器官成干方向老师，如需二维成干与实验，可邮件联系发送您参考，IPSC -POTOCOL,细工重点统计结合上述痛点难点都可讨论，统计关键词：

离体操作（活率高）自动化处理设备相关厂家暂时应该还没有理想机械与试剂结合理想方案（不排除有个例或保密方面）公开资料统计还没有。

成干培养—细工促贴壁试剂，原代应用，病毒提高滴度应用，都有独特可行方案（该数据来自免疫类细胞转染统计，原代转染三年统计几个优势厂家试剂结果给出的参考）

维持培养中含血清方案可行性，该点在细胞救助上方案可行性高，理由来自，胰岛胰腺，肠类已于几年应用统计。

冻存复苏优化：DMSO方法优化，可行性具体问题具体分析，PBMC已有两年都验证，更高活率还在研发优化中。

临床大夫用户，我们推出遇问则解方案推广，从问题点解决后，在继续下一步实验。该方案建议参考ALL CELL QUESTION IN ONE SHOT 。

20240301:

细胞培养中，生长慢讨论、黑点、细胞系成瘤不稳定解决参考

问题关于黑点
细工建议参考，用对试剂耗材（种子库级别细胞不建议用便宜试剂，保种上百只种子细胞，也用不了多少钱的）胰酶轻柔处理（避免枪直接吹打细胞损伤也是较重要指标参数），几代或十几代后，黑点会全部消失。这个建议也只是救助办法参考建议，经历过黑点的细胞，建议重新保种国内正规库来源细胞。

问题细胞系生长慢-原代生长慢-细胞养几代后就爬爬这种情况
细工建议参考 给出方案是进口瓶培养（康宁，nunc,德国产细工全部现货） ，种子库级别试剂（三千以上胎牛，我司验证五年以上南美）我司培养基或者是GIBCO培养基，放足培养基（多些也没关系）几天不动，看下恢复情况，结合我司胰酶（无损消化）传几代应该能找回较好状态，该方法也适合细胞养几代后就爬爬这种情况（上述方法也适合细胞养传代后细胞就爬爬这种情况，该因素原因很多，具体情况集体分析）该方法也建议原代首代培养（类器官）就是普通培养基加胎牛（因子贵，lag phase长、无血清不稳点）全部能替代，细胞够多或稳定后在上无血清可做参考。类器官配套耗材U型低（不加辅助条件成球）及磁珠配套磁力成球可来信告知索取资料及技术讨论。

成瘤不稳定组参考，首发少数技术老师参考
瓶，慢养慢传代慢生长，无损胰酶，少二氧化碳，减缓生长，减缓分化，理由：来自成干成球培养，难养细胞株痛点统计规律相似特点。分出一批评测，操作更简单，给成瘤不稳定组，提供一组备份条件，从成干特点上看（缺氧培养减缓细胞分化-这个特点又能起到明显作用后，我们可能考虑离体后巨噬培养看看能否控制细胞分化，后面给生产型用户做些技术储备），优势挺大的，也给出一套备份技术储备。
备注：如您对干细胞培养相关了解，相关参考也可发我下，我们一起验证优略。该思路来源类器官统计可行性及目前试剂耗材国产普及，我们目的是国产试剂耗材原代建系。冻存复苏优化应该也是原代建系中重点，相关问题心得都可讨论。

遇到上述问题的，保种级别试剂最重要，平时通过解决这类问题，评测出自己体系的保种试剂耗材很关键。这部份问题如果是冻存引起的，可讨论细节，今年统计重点，原代建系较重要节点。相关产品有兴趣老师可留言，新品出来可比较评测。

20240308

您在啥高度培养细胞
中国省会城市及直辖市海拔高度排名
1.拉萨:3656米，2.西宁:2250米
3.昆明:1922米，4.兰州:1537米
5.银川:1114米，6.贵阳:1061米
7.呼和浩特:1056米，8.乌鲁木齐:873米
9.太原:811米，10.成都:503米
11.西安:415米，12.重庆:273米
13.长春:241米，14.哈尔滨:148米
15.郑州:119米，16.南宁:79米
17.石家庄:78米，18.长沙:58米
19.北京:57米，20.沈阳:55米
21.济南:45米，22.武汉:39米
23.南京:28米，24.广州:26米
25.南昌:24米，26.合肥:20米
27.澳门:19米，28.台北:18米
29.福州:14米，30.杭州:12米
31.香港:11米，32.天津:10米
33.上海:9米，34.海口:8米
国内已有库海拔，
上海:9米
北京:57米
昆明:1922米
武汉:39米
拉萨，西宁高海拔培养细胞相关统计。
供参考：
海拔高度 海拔含氧量,细胞培养高海拔建系，建厂前期相关技术储备统计。
0米 100%
1000米 89%
2000米 79%
3000米 69%
4000米 60%
5000米 52%
6000米 45%
7000米 39%
8000米 33%

20240315:上述列出统计目的，为国内建系组做细胞救助技术储备，最近几年接触到不少相关培养方面的咨询，大部分细胞生长越养越慢，为优化国内建细胞做上述储备，做到建系重复易行，目前关键点列出参考。
1：离体处理（单组织处理，高通量处理可行性）、2：含血清（上清利用优略可行性）、3：团聚成片解决，4：冻存复苏、5：生长慢不容易消化（生长慢原因，细胞质量原因）、6：高滴度转染细胞可行性（电转）7：单克隆。
试剂技术统一后分析痛点给出我们认为的准确参考技术储备。国内工业应用细胞建系如有需求的优势，我们可做进口体系，国产体系，血替方案（就血替方案优势是，先做含血清相对容易，细胞量大，在该技术上在做血替方案会容易些，上来就是无血清，难度较大，除非有超越同类国外金标准公司才可行）。上述列出技术方面有国内专利公司，如能共享可合作应用效果统计。2005年后一些细胞培养方面临床培养经验非常棒，可大部份公司好的数据经验都没延续下来。这方面我们只做科研部份相关技术储备。

20240323 

成团成片阶段总结

2018年开始重点关注成团成片，因来源难养系，上皮，SV40，胶质为主这类问题及工业生产用细胞工厂大面积培养中提升细胞培养质量等需求，深入开发了相关胰酶消化产品，开发要点是细胞膜无损，还要消化成单个细胞，（冻存复苏步骤验证产品的优势及可行性）难转染细胞通过解决成团成片提高转染效率的案例统计，能够大大提升实验预期效果，

23年以来统计了不少类器官培养，成干培养中，免疫细胞、悬浮培养，胰岛胰腺原代中成团成片中问题，说些参考建议，后期验证有效果可来信告知，目的是有效无效不以个别案例说明有效，普遍案例大多数有效才证明可行，成团成片可看成组织内形态状态（分化后维持培养后续在统计讨论），有些共性。原代组织处理，也是消化成单个容易培养（离体后开关通路，较快适应培养体系并生长）成团成片培养相对难，也可理解成2D,3D培养。我们目的很明确的是，原代建系传代培养，在工程用2D培养细胞量会很大（在更大面积培养中细胞质量一致性尤为关键）

组织-细胞
细胞-组织

难养系，上皮，SV40
人肾皮质近曲小管上皮细胞；HK-2
人乳腺上皮细胞；MCF-10A
人肺正常上皮细胞BEAS-2B
人肝癌细胞；Hep G2 [HepG2] 上皮样
人胚肾细胞；293 [HEK-293] 上皮样
人脑星形胶质母细胞瘤；U-87 MG [U87MG；U87 MG] 上皮样

后期相关问题统计
维持培养，控制分化。分化后维持培养后续在统计讨论
离体后开关通路，培养中问题统计,上述SV40建系培养特点，细工技术储备充足，如您建系也用SV40,如遇到问题，可讨论。问题结合统计有些共性，也有组织特性，可讨论。

20240415建系更新参考 组织-细胞要点
1：离体处理，建议手术刀并排两三个固定后，冰上最快速度处理，建议十分钟内入皿
2：不管哪种培养体系，都要有一组含血清，这个每个实验室都很熟悉，上清前几代留着，后面建系中，细胞受损后救助（冻存复苏，长期培养驯化过程中细胞状态差等救助）
3：冻存复苏：建议两指厚面包裹后直接负80后，第二天液氮，有泡沫冻存盒裹在棉花外面效果更好，建议平时冻存复苏评测。较挑剔的有免疫细胞，原代等测试效果比较好，无血清方案，建议新式冻存方法评测比较。
4：建系病毒要点：高滴度。
5：技巧参考：要对细胞镜下形状熟悉，可不用分离液，流式等前期筛选，等大量培养后在做相关检测，避免细胞受损而使细胞培养不顺利问题。大大提升成功率，上述1-3是组织到细胞，4是难感染细胞痛点，要能理解上述要点，重复实验容易并可行，也是建系简单重复关键。

20240425:成瘤相关参考，成干验证，减血清，增长速度很有参考意义。
当单一的畸胎癌细胞种植到胚胎上时可以长成良性组织(Kleinsmith and Pierce，1964)，这提示在转化的细胞中表型改变是可逆的。
以至诱导分化经常被推荐作为肿瘤治疗的模型(SpremulliandDexter, 1984;Freshney,1985;Marks and Breslow,2007;Piccirillo et al.,2006; Wang et al.2008:Kangetal，2014)。
北医白凡，生物物理所-李翀老师，10-1000个细胞成瘤五六年前文献可查下,需文献可来信告知。

017-2015-CSC-lncTCF7
024-2016-Cancer Res-GALNT1

20240604

痛点补充说明
1：离体处理推荐步骤补充，该方案来自成团成片细胞系，原代问题统计，2010年开始。
统计了从2005年国内湘雅胰岛胰腺原代，2010开始统计胰岛胰腺细胞系（分离成单个容易活，胰泡，组织粘连不容易增殖，传代。解决这类问题，我司配套胰酶消化产品开发来自这些问题，该类同理问题是细胞工厂大面积消化（五年工业应用），所需消化时间长，前后消化细胞要保证一致，膜受损一致（常规0.25浓度胰酶，对膜损伤导致前后细胞质量不一致）每本细胞培养书籍及权威细胞库介绍最常用一句是，细胞变形后马上终止消化，目前各种胰酶原料来源差别也很大，相关评价过几个大厂原料，我们坚持原始原料能做到，超长时间消化，充分消化成团成片，横竖消化一致并细胞膜无损，后面有兴趣老师可讨论上皮类这类问题可验证。
上皮类细胞系SV40建系培养特点、胶质类细胞系、正常组织细胞系
有时间验证益处是，原代首代培养及第一代处理关键因素。难养系常见问题。
常年统计相关推荐：很多问题案例说明首代消化不下来，组织离体处理步骤过于繁琐，时间过长，影响的细胞活性，还建议不用化学成份，机械力干扰，（淋巴细胞分离液类，流式）细胞活性会更高，加普通培养基加含血清方案，保守的说传十代不成问题，胚胎类来源，精准手法，四十几代没问题。
混杂细胞培养在一起，后面详细介绍简单易行，单克隆几十个或上百个各类目的细胞，成纤维，上皮特性。离体生长顺利培养无BUG推荐。后期补充单克隆推荐potocol.
单克隆后稳转株建系，超量加药筛选，传代加药，复苏加药，痛点全部用充足的技术储备提出参考建议及应用案例。后期补充稳转株推荐potocol.
维持培养验证种子库级别试剂优略对建系方案要点说明，统一理念，对方案实施非常关键。后期补充维持培养验证对种子库重要性。
冻存复苏重点，后期补充冻存复苏验证对建系重要性。
后期补充资料有案例问题的都可提前讨论，问题实战最能说明可行性。
我们远景是完全国内建立工程系，理想有说服力的验证方式是五家以上实验室同时验证方案可行性（欢迎各位老师同学老板参与加盟），简单易行重复验证，可通过各类培养中问题讨论，试剂，耗材，培养环境，技术储备等

20240605

细胞培养上清回输可能原因有两种，一是分泌促生长因子；二是释放竞争性信号，刺激细胞增长，这也是细胞太稀不易生长的原因。建议：原代复苏首代救助，转染后死细胞过多等相关救助。

20240608

单克隆简易方法，新手操作一遍过，图片是新手第二次验证图。
细胞系验证按说明就可以，原代耐药株等可讨论痛点，
图二要点说明，两堆细胞，不生长单个的就不建议克隆，那堆生长顺利的，后面会生长顺利
留邮箱及实验室名称，后期稳转株POTOCOL出来，合作原代建系，
痛点讨论：离体处理、培养体系，稳转株药加量筛选稳转株、冻存复苏要点及各实验室验证陆续会有反馈数据。
离体活性更高可行方案：难消化下来大部分问题是活性这部影响的
培养方案：含血清可行性，可同时无血清同步
稳转株：超量加药筛选，
冻存复苏：基于DMSO方案，对冻存挑剔细胞系，原代高活率方案，无血清方案新型冻存液方案对比及问题统计
上述包括内容较多，这里不展开。

20240612

原代建系（技术储备充足后续做建工程系），目前细工技术储备理论上，无bug方案推广（该方案来自以下问题特点细胞竖向统计）。
国内各地开始，同步验证每个地区五个团队以上，讨论痛点难点可行后同步实验验证，包括各地区生物药创始人，重点室。
各部位从组织到细胞，成纤维，上皮，腺类

涉及统计资料、
二倍体细胞系培养特点总结（成纤维）
乳腺癌、肝癌、免疫悬浮，淋巴瘤、胰岛胰腺、（上皮）
原代痛点难点：离体处理、单克隆、稳转株、耐药株、冻存复苏优化
建系用病毒效价质量标准评价，

涉及其他实验痛点难点：维持培养、高滴度蛋白病毒生产、晶体研究、
SV40 MEF 大T抗原
纯化后蛋白保护、
原代免疫类、原代正常类、胶质类、

常用贴壁试剂：胶原、明胶、多聚类，粘粘蛋白、Matrigel基质胶、
细工开发促贴壁试剂不同处，毒性几乎没有（救助难养株案例五年统计）超长维持培养。

解决易成团成片问题，这类问题影响细胞活率，维持培养、转染效率不高，冻存复苏活率低。种子库细胞活性维持、单克隆反复保重（简易单克隆法有需要来信告知实验室名称），结合最近几年热门研究痛点问题统计：PDX、单细胞、类器官、给出相关问题理论与实战案例参考，理想状态是平时培养过程中的问题验证效果最好，先有案例问题解决，后面应用会更稳妥，并可行、易行
易成团成片常见系统计如下：
神经胶质类系（BV2,A172,U87MG、U251、TJ905、HS 683、H4、GOS-3、C6、原代上皮首代
各类难养系及原代上皮类:原代上皮首代、SV40、大T抗原系，293、HUN7、HEPG2、HEP3B
免疫悬浮类：THP-1，RAW264.7,JURKAT,HuT 78、RAMOS(RA.1)、NTCC721.221\IM-9、SU-DHL-4、KMYF、DCS

腺类原代、细胞系（腺癌、结直肠腺、前列腺、内膜腺、肾上腺、胸腺、胰腺
腺癌
人乳腺癌细胞；
MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-435S、MDA-MB-453、MCF 7B、MDA-MB-157、SK-BR-3、MDA-MB-468、BT-20、MDA-MB-415、MDA-MB-436、MDA-MB-361、HCC1937
人乳腺导管癌细胞；
ZR-75-1、HCC38、ZR-75-30、T47D [T-47D]、BT-549 [BT549]
人乳腺导管瘤细胞；
UACC812、BT-474、MDA-MB-175Ⅶ、MDA-MB-134Ⅵ
人乳腺上皮细胞；MCF-10A、DU4475
人整合SV40基因的乳腺上皮细胞；HBL-100 [HBL100]

人结直肠腺癌细胞；
Caco-2、HCT-8 [HRT-18]、HT-29、COLO 205、COLO 320DM [COLO320DM]、HCT 116 [HCT116]、LoVo、SW480 [SW 480；SW-480]、SW620 [SW 620；SW-620]、HCT-15 [HCT15]、LS 174T [LS174T]、COLO 201
人结直肠腺癌瘤株；HCT 116 [HCT116]

人前列腺癌细胞
DU 145 [DU145；DU-145]、LNCaP、Vcap、PC-3、2B4
人前列腺癌细胞
22Rv1、DU 145、 VCaP、PC-3
人前列腺癌高转移细胞株；PC-3M IE8、小鼠前列腺癌细胞；RM-1、人正常前列腺基质永生化细胞WPMY-1、人正常前列腺上皮细胞RWPE-1

人卵巢腺癌细胞；SK-OV-3、OVCAR-3
人乳头状卵巢腺癌细胞；Caov-3

人子宫内膜腺癌细胞；
HEC-1-B [HEC-1B；HEC1B]、KLE、Ishikawa、HEC-1-A
人子宫内膜低分化腺癌细胞；EAG3

人肾上腺皮质癌细胞；
SW-13
人十二脂肠腺癌；HuTu-80、人肾细胞腺癌细胞；ACHN、人子宫内膜低分化腺癌细胞；EAG3、大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞；PC-12 [PC12]
甲状腺
人甲状腺鳞癌细胞；SW579 [SW 579；SW-579]、人髓样甲状腺肿瘤细胞；TT、人滤泡状甲状腺癌细胞；FTC-133、人低分化甲状腺乳头状癌细胞；B-CPAP
人甲状腺癌细胞（未分化）、8305C、ACT-1、（乳头状）B-CPAP、BHT-101、C643、CAL-62、HTh-7、Hth83、KHM-5M、KMH-2、KTC-1、Ocut-2C、TTA1、ARO、FRO
人甲状腺鳞癌细胞SW579 [SW 579; SW-579]、人髓样甲状腺肿瘤细胞；TT

胸腺：人胸腺激酶缺陷型细胞；143TK-、犬胸腺细胞；cf2Th 中国食品药品检定研究院
肾上腺：SW-13、 人肾上腺皮质腺癌细胞；NCI-H295R 、人肾上腺神经母细胞瘤细胞(脑转移)；KP-N-NS、红色荧光蛋白和萤光素酶标记的SW13-luc2-tdT 、大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞；PC-12 [PC12] 、

胰腺
： 人胰腺癌细胞；PANC-1；人胚胎胰腺组织来源细胞；CCC-HPE-2 ；人胰腺腺泡上皮癌；HPAC；人胰腺癌细胞；AsPC-1；人胰腺导管癌细胞；CFPAC-1；人原位胰腺腺癌细胞；BxPC-3 ；人胰腺癌细胞；HS 766T ；人胰腺癌细胞系；SW 1990
肺腺： 人肺腺癌细胞；Calu-3 、人非小细胞肺腺癌细胞；NCI-H157 、人低分化肺腺癌细胞；SK-LU-1、人非小细胞肺腺癌细胞；NCI-H1975、人非小细胞肺腺癌细胞；NCI-H2087、人肺腺鳞癌细胞；NCI-H596、人肺腺癌细胞；NCI-H2009

就重点原代培养中常见痛点问题：细工前面已有介绍部份，解决方案讨论黑点，生长慢、成瘤不稳定、离体首代消化不下来、简易单克隆法、稳转株筛选法、冻存复苏，都有充足技术储备。平时培养过程中问题解决欢迎讨论。
前期相关各种难点痛点都可讨论与验证（邮件沟通，注明实验室名称）

20241117

案例汇总，黑点解决思路方法参考

问：
想请教一下各位老师，图里的是293t细胞，红框标识的地方细胞内有小黑点，而且会动，请问这可能是什么，有什么处理方案吗；当前尝试使用左氧当作支原体处理，目前看来无效？
就是怀疑细胞里面的黑点是某种胞内微生物污染
准备检测一下

答：
黑点讨论：用瓶用皿，生长时间多久，胰酶浓度可低些，提高血清浓度，换成瓶进口的，恢复下，养几天试试，要是生长时间长，上述很管用，血清厂家货号，培养基效期列出下，要是时间太长，补谷氨酰胺，或换成叫新批次，按上述做下，如有条件换成大牌子进口的，养几代会有改观。如有效果来信告知。我们统计黑点，生长慢问题

黑点发生，培养液不新鲜，血清营养含量不够，生长慢后，皿容易PH变化大，导致越来PH变化越大，过酸或过碱，瓶能改善，并能恢复，参考。我觉得检测意义不大，上述要列出来，问题就能很快排除，培养基都差不多，后面要长养细胞，叫新鲜要对厂家说出来，或者自己有补救办法。说的不对处请海涵。

验证后，再出现黑点问题，能很快排除，目前几个组按上述验证，用户还比较满意。

低浓度胰酶，0.05是个好习惯，消化时间虽然长些，膜无损更重要，正规库几个老技术都推荐，也不反驳同学用，0.25我们做自动化培养冗余试剂开发，胰酶浓度很关键。

0.25消化后的细胞，传代后会先恢复细胞膜在生长，细胞工厂大面积消化，我们有统计，还有就是成团成片类特性细胞，0.25容易把外面消化成泥，里面也没消化透 ，并伴随细胞老幼状态，上皮类团聚尤甚，293就是上皮类案例，老幼情况出现，细胞状态不一，难做后面实验，参考

避免建议，小克隆形成后，就用低浓度胰酶，消化成单个传代，大面积在消化，老幼问题用以出现，案例细胞，mdck

总结：类器官、人造肉、自动化培养、建系、微流控制培养等应用，长久看，各种培养中问题都要解决或者有突破，细工生物在这方面，根据自己能力财力，推荐含血清方案为主(容易实现，也是无血清培养条件验证大量细胞拿到验证前提，即便是临床研究应用目的，细胞量也是摸无血清培养条件前提)目前国内已有公司推出把类器官培养100培养工作一天完成成瘤成球，延展讨论以下体系培养中问题统计(涉及统计内容较多，有需要可留邮箱）。

20250102

类器官相关-2025
-微血管内皮的培养及在医学研究中应用现状，大规模细胞培养的方法，干细胞培养相关的新产品。
1：类器官培养过程中无法实现血管化营养供给。 体外培养类器官的营养来源主要依靠培养基提供，其大小会受到较大影响。 目前类器官培养的适宜大小为直径１００～２００ μｍ，当类器官尺寸较大时，中央区域的细胞面临与外界交换氧气和营养成分的困境，因此随着结构尺寸的增大，细胞死亡的比例也会上升。 目前，多项研究致力于解决类器官血管化的问题，包括建立血管类器官
2：从而构造更拟合人体的类器官模型。 同时，器官芯片的压力、流速可控的灌注系统一定程度上为类器官血管化问题，提供了解决方案。
3：类器官受取材位置及大小的影响，肿瘤整体代表性不足。 目前类器官的取材来源主要包括实体或液体活检、手术切除以及尸检样品，但是这些材料来源相对于肿瘤整体来说较为单一，代表性不足，在反应肿瘤异质性方面说服力不够。 由这些样本构建出的类器官不能代表肿瘤的整体情况，因此其药物反应的真实性难以确定。
4：与体内生长情况不同的是，某些肿瘤类器官体外生长速度反而不及组织来源的健康细胞，因此这类肿瘤类器官在培养的过程中很有可能失去生长优势，被正常类器官取代。
5：器官芯片倒是符合各实验室研究类器官初步吻合也合适的研究，用“芯片”模拟人体器官功能 简单来说，器官芯片是一种微型设备，它通过在芯片上构建类似真实人体组织的三维结构，用以模拟具体器官的功能与反应。与传统动物实验相比，器官芯片具有更高效、更精准、更具伦理优势的特点。这项技术的发展，有望彻底颠覆当前药物开发、疾病研究和个性化治疗的方式。生物医学和微纳米加工技术的发展，器官芯片从概念走向实践已成为可能。
高度精密制造工艺、高质量活体细胞来源以及跨学科协作等问题，都需要进一步攻克。更加意识到提高医疗效率、加快药物研发的重要性。而以往依赖动物模型进行试验，不仅周期长、成本高，还存在伦理争议。相比之下，器官芯片能够显著缩短新药研发时间，同时降低失败风险，高度精密制造工艺、高质量活体细胞来源以及跨学科协作等问题，都需要进一步攻克。细工在自动化培养中冗余试剂开发这个点做些微小的面开发产品，
从癌症靶向药物测试，到罕见病的新疗法探索，再到个性化治疗方案制定，每一个环节都可能迎来革命性的变化。甚至有专家大胆预测，在未来十年内，大量复杂的人体实验或许都能被“替代”为更安全高效的模拟测试！

脑类器官在药物研发中的研究进展
线粒体定位Mito-DsRed2-Hela稳定细胞株说明书
探针
肿瘤模型
肿瘤机制
肿瘤机制:亲代肿瘤的基因组、转录组、蛋白质组等多组学特征,细胞系模型所缺乏的异质性
临床前模型
肿瘤类器官；精准治疗；类器官生物样本库
肿瘤细胞系（ ｐａｔｉｅｎｔ⁃ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｕｍｏｕｒｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，ＰＤＣｓ）
患者来源肿瘤异种移植瘤（ｐａｔｉｅｎｔ⁃ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｕｍｏｕｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ，ＰＤＸｓ）
类器官模型（ ｐａｔｉｅｎｔ⁃ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ，ＰＤＯｓ）
患者来源的肿瘤类器官（ｐａ⁃ｔｉｅｎｔ⁃ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｕｍｏｒ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ， ＰＤＴＯｓ）

酶水解的方式可能会导致细胞间的相互作用减弱甚至消失，酶解离方式相比 机械切割法保留了组织和肿瘤微环境中细胞成分的天然结构，从而调节类器官的形成和表型。 但这种方法的缺点在于机械切割所产生的组织碎片会使被包裹细胞的胞外环境不均匀，包括不均匀的氧浓度和营养梯度。 钝性的组织切割也会损害肿瘤样本，使得最后所得的活细胞数量减少
配套品各厂家分析，研发生产提前技术储备
基底膜提取物（ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｘ⁃ｔｒａｃｔｓ，ＢＭＥ）将其包裹，并接种于孔板内形成穹顶样ＢＭＥ 是从小鼠Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ⁃Ｈｏｌｍ⁃Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）肉瘤细胞中纯化出来
的一种可溶性基底膜，类 似 的 物 质 还 包 括 Ｍａｔｒｉｇｅｌ 和 水 凝胶［６］常见的因子包括 Ｗｎｔ 通路激动剂（ Ｗｎｔ⁃３ａ、Ｒ⁃Ｓｐｏｎｄｉｎ １），ＴＧＦβ 通路抑制剂（Ａ８３⁃０１、Ｎｏｇｇｉｎ），ＭＡＰＫ 通路抑制剂（ＳＢ２０２１９０）以及生长因子等---有兴趣开发相关产品可留言讨论，我司在细胞质量一致性用在生产中，细胞规模培养，维持培养，产物上游研发有很多优势。

１） 浸没培养法，这是类器官培养模式中最为经典的方法。 该方法广泛用于各种肿瘤类器官的培养中，即孔板中包含类器官的胶体，凝固之后再加入无血清的培养基完全淹没。 这种培养方式被用于早期类器官模型的开发，成功培养出了
胃［７］、结直肠［８］、肾［９］、胰腺［１０］、肝脏［１１］ 等类器官。
２） 气⁃液交互培养法，分内外皿两个部分，即内皿放置类器官，外皿放置培养基，且培养基的液面高度不高于类器官高度，这样既可以通过直接暴露于空气中从而促进气体交换，又可以通过底部的小孔吸收营养物质供类器官生长。 这种方式有利于保留免疫微环境中部分免疫细胞的成分，为研究肿瘤免疫微环境的调控机制及后续的癌症免疫治疗提供了良好的体外模型.
３）不同细胞共培养，这是一种在同一培养环境中直接或间接培养多种不同细胞类型的方法。 肿瘤微环境的重塑是目前各种模型研究中的重点和难点，共培养模式的提出一定程度上解决了这一难题，如肿瘤类器官与免疫细
胞、成纤维细胞共培养使得其更加真实地模拟体内肿瘤生态位，还原体内药物反应。 此外，还可根据不同的研究目的设计不同细胞和类器官组合的共培养体系，更加高效地进行研究。

Ｈａｎｓ Ｃｌｅｖｅｒｓ 团队通过患者来源的大细胞神经内分泌癌（ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＬＣＮＥＣ）类器官的建立确定前神经转录因子（ＡＳＣＬ１）是 ＬＣＮＥＣ 对 ＢＣＬ⁃２ 抑制剂治疗反应肿瘤类器官用于抗肿瘤药物的高通量筛选

肿瘤类器官样本库的建立将成为新药临床前研究的有力工具类器官模型以其遗传特征稳定性、多克隆、反应供体病理生理特征以及可传代的特征受到广泛关注。 以肿瘤为例，消化系统和生殖系统建立了最多的生物样本库。 其中，结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、胶质瘤和膀胱癌的类器官培养技术最成熟。

接近体内病理生理状态，提高其模拟的精准性。 此外， 基于类器官理论， 新的模型如器官芯片［２４］和 ３Ｄ 3D生物打印［２５］得到进一步发展，为建立更好的模型提供新的方案。
３Ｄ 培养-细胞嵌入到三维基质中，
肿瘤类器官生物样本库
移植瘤-痛点统计

20250128

20250323

In the seven-year summary of product development, the traditional research literature of this kind of application is mainly polylysine and gelatin (glia), and in recent years, the application of Matrigel in organoid research has been mainly (many automated culture supporting products) and the advantages of fine engineering products are introduced from the construction of the system, industrial application (long-term culture, seed bank, system construction purpose, protein crystal research), and the key words are clumping into pieces, ultra-long maintenance culture, and over-culture.

From organoid research, drug screening application cell line supporting automation in the long run may be more suitable, the difficulty of building a system from PDX, organoid cancer part of the difficulty, but also for the cooperative laboratory strongly recommended that the seed bank to save the domestic regular library, Xiehe, Shanghai, Wuhan, Kunming library, the order is the second verification of cell identity is correct, and from the technical description of rationality, applicability is high, feasibility, we can do publicity case assistance, line building reagents, technical methods, containing serum is easier to achieve, and can culture a large number of cells. It will be much smoother to do serum-free research and development, serum-free common problems, no proliferation for several months, and it is difficult to make progress and breakthroughs to the experimental progress (what is wrong is corrected by the teacher)
Polylysine: From the analysis of neuronal glial experiments, short-term culture, confocal and patch-clamp experiments can solve the problem, and the purpose of system construction is relatively difficult.
Gelatin: There are few applications of organoids, and many laboratories are still developing industrial production applications.
Matrigel: The mainstream application of spheroids, the application of the purpose of building the system, the spheroids are tight, and it is difficult to break through the pain points of proliferation after affecting more than 200um, from the statistics of a large number of two-dimensional culture problems to the purpose of building the system, it is difficult to break through in the later stage of over-cultivation, and we are also waiting for new technologies to overcome the pain points.
Cohesin: The storage temperature of protein is high, and the temperature control requirements of automatic culture applications are difficult to apply, which is difficult from the perspective of feasibility.
Fine-engineered enhanced adherent reagent: from the problem solving case, and the purpose of system construction, overdose, ultra-long maintenance, automation application supporting redundancy, cell growth rate, cell number control, can be controlled by oxygen content, serum content control, buffer capacity super (serum-free and serum-contained) fault tolerance to maintain the cell state, more suitable for automation matching. Automated pre-experiment in the early stage of cultivation is feasible, easy, fault-tolerant, redundant and other multi-faceted verification, which can be automated and can be used as a standard with manual pre-experiment results, and the feasibility is stable.